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醫學論文:感染慢病毒HSV1-sr39tk的腎癌細胞GRC-1的建立

文秘站 | 編輯:阿榮 2012-12-5錄入 | http://www.directory-melhoressites.com |

自殺基因療法已經廣泛應用于各種腫瘤的基礎研究和臨床實驗性研究中。HSV1-tk/GCV系統是腫瘤自殺基因治療中研究最為廣泛且療效得到肯定的前體藥物系統。將該系統導入腫瘤細胞,從而誘導腫瘤細胞凋亡,可用于腫瘤治療的研究。本研究建立攜帶增強的突變型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-sr39tk)基因的慢病毒感染的腎癌細胞株GRC-1的方法。
1 材料和方法
1.1 主要材料 HSV1-sr39tk由美國加利福尼亞大學Sanjiv S.Gambhir教授惠贈。含HSV1-sr39tk的慢病毒載體轉移質粒pTK151/39tk由本室構建。人胚腎293T細胞、GRC-1細胞由本室保存。限制性內切酶、T4DNA連接酶、總RNA抽提試劑盒及RT-PCR一步法試劑盒均購自Promega公司。PCR引物由Invitrogen公司合成。
1.2 方法
1.2.1 慢病毒顆粒的包裝 采用改良的磷酸鈣沉淀法進行轉染。將轉移質粒(pTK151/39tk為實驗組,pTK153為對照組;實驗組含HSV1-sr39tk,對照組含綠色熒光蛋白)15 μg、包裝質粒ΔNRF 10 μg、包膜蛋白質粒VSV-G 5 μg共轉染293T包裝細胞,轉染12 h后,每日在熒光顯微鏡下觀察對照組熒光表達情況,72 h后收集上清,0.45 μm濾器過濾后分裝貯存于-80℃備用。
1.2.2 慢病毒感染GRC-1細胞及其鑒定 復蘇的GRC-1細胞系于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中傳代培養,培養液為含青霉素1×105 U/L、鏈霉素100 mg/L及體積分數為15%的小牛血清的RPMI 1640。達到實驗所需細胞數量后將細胞稀釋成0.5×108個/ L,分轉24孔培養板培養24 h后備轉染。分2組(實驗組和對照組)按6×109/L將GRC-1細胞接種至50 ml培養瓶中。將上述包裝好的病毒以感染復數(MOI)3∶1比例感染GRC-1細胞,培養3 h后加入2 ml RPMI 1640完全培養液繼續培養,24 h重復感染,48 h后在熒光顯微鏡下觀察對照組熒光表達情況。提取感染后的GRC-1細胞的總RNA行RT-PCR。所用PCR引物序列如下:上游引物P1為5′-ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT-3′,下游引物P2為5′-TCA GTT AGC CTC CCC CAT CT-3′。按RT-PCR一步法試劑盒方法建立如下反應體系:AMVI Tfi 5×反應緩沖液10 μl,dNTPs (每dNTP 10 mmol/L)1 μl,上游引物 3 μl,下游引

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